四、mNGS的基本流程和管理要求
临床微生物实验室mNGS的基本流程包括标本采集、运送、核酸提取和富集、建库测序和生物信息分析来鉴定感染的病原体。
（一）标本采集
共识18 从正常无菌部位采集mNGS检测标本，应严格无菌操作，避免污染；从有菌定植或污染部位采集的标本，应采取必要措施，尽量减少污染；用于宏基因组RNA测序的标本，应添加核酸稳定剂。mNGS标本的运送须防污染、防震荡、冷链快速运送；标本如不能及时检测，应保存于低于-70 ℃冰箱或液氮（血液标本应分离血浆后保存）。建议的常用临床标本采集要求和相关说明见表1。
如果临床标本提取的DNA初始浓度低（尤其是用去宿主核酸提取方法），建库时可能需要扩增，这会造成污染被放大。因此用于mNGS检测的标本一定要严格无菌操作。当mNGS检测应用于有菌部位标本（如呼吸道标本、粪便等）时，微生物菌群会使测序结果对病原体的解释更加困难。如果标本中宿主细胞含量高，在测序数据量恒定（如20M 读长）的条件下，核酸提取如不去宿主，会造成测序结果大部分来自人基因组，而病原微生物基因组序列相对较少。
标本转运装置的类型、贮存时间和温度影响核酸的数量和完整性。许多转运装置存在微生物DNA，会导致mNGS检测假阳性和背景污染物的引入。因此，应使用无菌、无核酸容器收集和运送标本，同时尽可能冷链运送，缩短运送时间，送检新鲜标本。
（二）DNA/RNA提取
共识19 建议实验室的核酸提取流程、病原体核酸提取试剂盒应经过验证；高宿主背景标本提取时应采用经过验证的方法去除宿主细胞或核酸；整个提取过程必须有防污染措施，包括阴性对照和阳性对照等。
DNA/RNA提取方法是导致mNGS结果差异的一个重要因素。核酸提取方法中的一些细节会影响mNGS结果，包括离心、纯化、DNA消化、核糖体RNA（ribosomal ribonucleic acid，rRNA）去除、RNA或DNA分离以及随机扩增等。
核酸提取试剂盒至关重要。不同试剂盒对不同病原体的提取效能不同，例如有些试剂盒适合提取病毒，但提取真菌的效能差。因此，必须对选取的病原体核酸提取试剂盒进行验证，包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、病毒、寄生虫等核酸提取效能的验证，避免病原体的漏检。
mNGS的局限之一是标本高背景导致检测灵敏度降低。高背景主要来自人类宿主（例如，组织活检标本）或微生物菌群（例如，呼吸道标本、粪便等）。一些感染中的病原体载量可能非常低（<103拷贝/ml），例如，腹泻患者粪便中的志贺菌载量或虫媒传播发热性疾病的患者血浆中寨卡病毒的载量［37, 38］。对于这些患者的感染性标本，如果存在高背景，当测序深度不变时，会漏检致病病原。因此，对于高宿主背景的标本，须在提取的过程中去除宿主细胞或核酸。
部分污染可能来自核酸提取试剂盒，即“试剂盒基因组”［39］。为了确保内部的有效性和可重复性，并确定潜在污染，应将所有提取和测序过程的室内质量控制作为标准操作程序的一部分。阳性对照通常加入DNA或RNA，例如合成核酸标准品如Sequins［40］；阴性对照通常是空白样品（例如预期不含微生物基因组的人源核酸），或者理想情况下是相似或相同的基质（组织、体液等），根据患者因素和测试结果，这些基质预期不含微生物基因组。进行临床宏基因组学检测的实验室检测必须纳入外部控制系统，如外部质量保证/能力验证。
（三）建库和测序
共识20 建议采用经过验证的流程进行建库和测序；建库慎用各种扩增方法，因为扩增会使正常菌群或污染病原体的序列扩大，难以判断真正病原体；测序原始数据应进行质控，并且过滤掉低复杂度、低质量的序列，确保测序原始数据的质量。
大部分mNGS建库过程需要进行扩增。不同物种的克隆扩增效率不同，这会导致背景污染的物种读长数变得很高，mNGS结果判断更加困难。
不同的宏基因组测序平台可能会产生不同类型的读长，例如，单端和双端、短读长（50~300 bp）和长读长（>1 000 bp）。测序平台的错误率不同，错误读取碱基的概率不同，从Illumina测序仪的小于0.01%到Oxford nanopore测序仪的5%~10%（截至2020年2月）［41］。此外，测序仪在处理具有大的均聚物重复序列、富含GC、结构重复以及基因组其他复杂区域的样本时，往往会错误地读取碱基。因此，报告物种组成时需考虑结果的假阳性和假阴性。
RNA的文库制备比DNA更耗时，但在某些情况下，RNA测序比DNA测序更有益。首先，如果仅提取DNA，则RNA病毒无法检测到［42］。其次，进行总RNA提取/测序可捕获DNA和RNA的表达，并且mRNA序列可翻译成蛋白质。氨基酸序列比核苷酸序列更保守，因此可产生更明确的分类信息［43, 44］。
（四）生物信息学分析
共识21 建议生物信息学分析流程应进行性能确认和验证，包括数据库的优化、比对方法和比对参数的优化等，确保准确报告致病病原体。
不同实验室或商业公司会采用不同生物信息学分析流程，应清楚描述所使用的生物信息学方法，包括软件名称、版本、主要命令等。
典型的生物信息学流程从原始输入fastq文件开始，系列分析步骤包括低质量和低复杂度序列过滤、去除接头、去除宿主序列、与参考数据库比对进行微生物鉴定，可选做序列组装、耐药基因和毒力基因鉴定等。仔细评估生物信息学分析流程中的每个步骤，以确保数据处理的准确性和完整性。生物信息学分析流程必须经过性能确认和验证，包括将对照和患者数据集进行分析和比较，并通过常规临床测试来确定最终结果的准确性［14］，目前尚缺乏标准。
五、mNGS应用于感染性疾病病原诊断的质量管理保证
目前，尚无国家药品监督管理局批准的用于感染性疾病检测的mNGS试剂盒。因此，每个临床实验室必须验证实验室开发的测试系统，包括核酸提取、文库制备、测序和分析流程，各组件的任何更改都须重新确认。
mNGS检测的质量控制对于确保性能准确至关重要。由于mNGS是复杂的多步骤测试，因此需要多个质量控制指标，包括样品对照、外部对照、内部对照、文库质量指标、测序质量指标和污染对照。实验室可以采用可接受的标准来定义每个参数，以确保样品质量和运行质量，并保证在样品处理中不发生错误。
mNGS污染、结果解释、用于分析的数据库及根据测序数据预测药敏等问题，仍存在挑战。每个样本添加已知序列和已知浓度的内部样本质控；每一批包含两种外部样本质控：阴性质控或环境质控（缓冲液）、阳性质控［已知浓度的革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、病毒（可选）、寄生虫（可选），如表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和烟曲霉］。
（一）特殊病原体的DNA/RNA提取技术要求
共识22 建议病毒核酸提取应保证病毒核酸的完整性；对于细胞壁较厚的病原体应采取常规方法以外的破壁方法。
病毒mNGS诊断的关键问题是在提取过程中保持病毒核酸的完整性，并利用临床上有重要意义的病毒提取方法。对于一些细胞壁比较厚的病原（如分枝杆菌、真菌等）［15］，常规核酸提取方法难以保证核酸提取的质量，因此需要使用一些特殊的破壁方法，并标准化。
（二）标本采集、DNA/RNA提取、建库引入的实验室污染问题
共识23 污染既包括标本采集、核酸提取、建库测序引入的污染，也包括生物信息学分析引入的污染；建议实验室自建有效的防污染策略，包括使用背景微生物库的方法。
采用mNGS进行感染性疾病诊断最大的瓶颈是污染导致假阳性。“污染”来源包括实验室试剂或环境中检测到的背景微生物和正常人体菌群，以及生物信息分析或数据库错误（例如错误注释），这些错误均可能导致物种识别错误。在样品收集、核酸提取、文库制备和混样过程中引入的少量外源DNA或RNA都能从污染的读长中产生可检测的信号。此外，实验室物品表面、耗材和试剂可能均含DNA。因此，mNGS检测的复杂性要求人员训练有素，样品处理过程格外小心，以避免操作错误和交叉污染。
对于任何进行分子分析的实验室而言，污染的风险始终存在。实验室应通过合理的布局、环境洁净度控制、质量控制、单向工作流程和严格的去污染方案来减少风险。实验室可能需要mNGS的专用空间，以最大程度减少污染。但许多临床实验室因空间狭小而无法建立mNGS检测专区。
可有效避免因污染而误读mNGS结果的策略包括：（1）根据临床微生物专家和临床医生的指导添加解释性注释；（2）使用替代方法确认由mNGS新鉴定的物种；（3）实施污染监测策略，例如专用的污染参考数据库；（4）由经验丰富的实验室主任和专科医师主持的实时电话会议（临床微生物测序委员会），结合临床实际与主管医师讨论检测结果［13］。
（三）测序深度对结果的影响
共识24 建议实验室验证不同标本、不同感染类型病原体检测所需的测序深度。
实验过程中测序深度不同主要是测序平台的通量不同和上机的均一性决定。不同标本的测序深度需求，主要是由不同的标本的宿主背景比例、微生物多样性决定，其次是不同测序平台和测序成本的影响［45, 46, 47］。测序深度对低丰度物种鉴定、对测序数据可信度均有影响［45］。测序深度影响mNGS的敏感性。尽管mNGS比涂片或培养更敏感，但大多数情况下，它不如靶向核酸扩增灵敏，部分原因是因为检测过程中对大量人类DNA/RNA进行测序和去除。分析灵敏性也可能因病原体而异［48］。影响mNGS敏感性的其他因素包括标本采集的时机、标本稳定性和来源及方法学变量，如提取方法、文库制备和数据分析［48, 49］。去除宿主核酸有利于提高用于感染性疾病病原体检测的mNGS灵敏度［50］，但去除宿主核酸同时，也会损失一部分病原体核酸。
（四）生物信息学分析结果中疑似背景微生物对病原诊断结果的影响
共识25 建议实验室建立自己的背景微生物数据库以控制假阳性结果。
分析前、分析中和分析后的每个阶段，mNGS检测的特异性都会受到影响。在mNGS的技术性能中，阴性对照和基因组覆盖对照能帮助从试剂或实验室中鉴定外源DNA。在某些平台上，一些序列可能会被错误拆分（即索引跳变，index hopping），如在分析过程中不加以控制和过滤，会导致假阳性结果［51］。在数据分析和序列比对期间还会出现其他问题，包括分类错误、数据库错误以及鉴定非源自患者样品的DNA。
尽管在验证过程中可以通过适当的控制来解决分析特异性问题，但更大的关注点在于mNGS测试的临床特异性，如检测的序列与患者当前的疾病过程符合程度，不同宿主间病原体核酸的半衰期或潜伏期，报告阳性结果的阈值及不同的疾病过程或宿主的阈值差异等。
检测中需建立背景数据库，包含mNGS数据中可检测到的正常菌群或实验室污染引起的背景微生物［4］。如背景库中微生物具有临床意义，报告时需更高的报告阈值，而这个阈值需要通过验证获得。
（五）病原诊断阈值的设定
共识26 考虑建立mNGS的诊断阈值以排除背景微生物的干扰、改善检测结果的准确性。
实验室应基于自己的mNGS流程，针对不同感染类型，设定不同病原体的诊断阈值来发放报告。
建立阈值区分真阳性与实验过程中污染的微生物，且这些阈值包含度量标准，例如与检测到的微生物比对上的读长数、标准化为百万分之一的读长数、外部无模板对照样本或内部添加物质的读长数、覆盖非重叠基因组区域的数量及相对于阴性对照样本的临床样本中的读长丰度（以避免报告污染物种）。ROC曲线分析是确定已知结果的临床样本训练集的最佳阈值的有用工具，并使用独立的验证集验证预先设定的阈值［14］。大多数验证研究使用残留冷冻样本，而不是前瞻性采集的新鲜样本，这限制了对样本稳定性和时间变异性的评估。不同标本类型、不同病原体的诊断阈值可能不同，实验室应建立常见标本类型、常见病原体的诊断阈值。
（六）数据库对病原学诊断结果的影响
共识27 建议实验室验证自建的数据库中物种的准确性，过滤数据库错误和不正确的序列，并定期更新数据库。实验室应尽最大可能完善病毒、真菌和寄生虫数据库，提高鉴定的敏感性和准确性。
小型精简数据库或严格标准数据库可能不包括新的或少见物种，从而导致假阴性结果。未精简数据库或宽松标准数据库也可能会错误鉴定物种。目前，各实验室或商业公司的数据库都是自建，缺乏标准化。标本污染或不完整（如基因组中包含重要突变的不完整区域）产生的序列是参考数据库的常见错误特征，尤其是包括基因组草图时。如超过1 000个已发表的微生物基因组序列已鉴定为被phiX174污染——phiX174是一种在Illumina测序中用作对照的噬菌体［52］；2 250个NCBI GenBank细菌和古细菌草图基因组含有虚假的人类序列［53］。假阴性也可能是数据库中缺少某物种所致。
真菌和寄生虫拥有庞大基因组，可与人类宿主序列相混淆，并且可能低滴度存在于临床标本中，给mNGS带来挑战。目前临床上重要的真菌和寄生虫物种的数据库有限，这更给mNGS分析带来困难。
微生物参考基因组的公共数据库不断更新，实验室除处理潜在的错误注释和其他数据库错误外，还需定期更新数据库。尽管公共数据库（如NCBI的核苷酸数据库）更多、更完整，但是它比经过精选的序列有限的数据库［例如FDA-ARGOS［54］或FDA参考病毒数据库（RVDB）［55］］包含的错误也更多。整合多个数据库的注释序列可提高微生物鉴定的敏感性和特异性。
六、mNGS应用于感染性疾病病原诊断的性能验证和标准化
mNGS检测微生物的性能、有效性和临床意义是亟待解决的问题。可采用“代表性物种”方法，使用单个物种作为检测该类别中其他病原体（如DNA病毒、RNA病毒、革兰阴性菌、革兰阳性菌、酵母菌和丝状真菌）的代表［14］，以期对相似病原体具有指示作用。实验室应不断扩大所检测物种的清单，建立能可靠进行mNGS分析测试和报告的病原谱。
共识28 对mNGS整个检测和分析流程进行性能验证是其应用于临床的瓶颈，建议对感染性疾病常见的“代表性”物种进行检出限、包容性、抗干扰、精密度、携带和交叉污染、稳定性等的验证。
检出限提供对特定靶标分析灵敏度的度量，是指可以准确测序并与阴性样品区分开的最低浓度靶标，且在≥95%的重复样品中具有一致的检测能力。
包容性或分析反应性：指验证能够特异性检测病原体之间潜在的遗传变异以及耐药性和毒力标记的能力。包容性验证应使用培养的微生物。在某些情况下，可以使用预先提取和已知浓度的核酸，如稀有物种、不可培养物种、BSL3和BSL4物种等。评估中使用的靶标浓度应在设备的LOD处或附近。如mNGS检测并鉴定了肠沙门菌，建议在特定LOD或临界值附近进行检测，证明该方法可检测到所有常规报告的血清型。当菌株不可获得时，可通过对靶序列进行计算机分析来完成验证。
干扰物质验证：应该对临床标本中可能影响测序的干扰物质进行评估。临床标本的潜在干扰来源包括外源性物质（即药物、抗凝剂等）和内源性物质（即蛋白质、脂质、血红蛋白、胆红素等）。同时，应全面评估由测序仪引入的潜在干扰，包括预处理或洗涤过程中残留的化学物质。对未知序列应该验证：宿主背景的干扰；存在靶标污染物或其他微生物的干扰；不存在靶标时发生的交叉反应（非致病菌群，邻近物种）；PCR抑制剂的干扰。
精密度：当重复测试同一样本并引入多个变量时，应评估设备的可重复性。如可在多个地点使用仪器，并由不同的操作人员在不同的日期运行仪器，以评估可重复性。评估还应确定多种试剂批次对设备性能变化的影响以及对最终结果可能产生的影响。同样，在固定条件下多次分析标准物质时，应评估可重复性。
应评估残留污染的影响，包括样品制备和文库制备，其中将已知的阳性样本（目标浓度高）和阴性样本交替使用。应计算并报告以前运行的携带污染率。
其他验证：根据设备的预期用途、标本类型和研究设计，可能需要进行下列内容验证，包括矩阵等效性、新鲜和冷冻试剂稳定性、混合感染中评估含多个物种的标本。
七、mNGS应用于感染性疾病的报告解读
共识29 解读报告考虑如下参数：测序质量（是否去除低复杂度、低质量序列，Q20、Q30等）、读长、特异性读长、覆盖率、深度、丰度、微生物序列的数据量、阈值等。
共识30 mNGS检测报告中，建议结合不同标本类型与检出病原微生物的种类进行解读，区分无菌部位（血、无菌体液、组织、骨髓等）与正常有菌部位（如呼吸道、尿液、开放性伤口）。确认致病微生物时，应考虑检出微生物是否为感染部位的潜在病原。如脑脊液检出新型隐球菌，呼吸道标本检出结核分枝杆菌、腺病毒、流感病毒，关节液或血液标本检出布鲁菌属，均可认为是致病微生物。注意排除常见定植菌、污染菌与工程菌的影响。
共识31 血浆样本对cfDNA进行mNGS检测时，建议从临床的角度鉴别检出序列属于致病微生物、样本污染、死亡微生物裂解，还是定植菌群所致的一过性菌血症。
mNGS检测中，来自环境、检测试剂的细菌、病毒、真菌的序列也将混杂其中，深度测序时会将其信息放大。对于检测结果中出现的罕见致病报道的环境中微生物，应首先考虑污染所致［56］。注意识别检测报告给出的常见定植菌、污染菌与检测试剂中工程菌［48， 50］。
实际工作中，mNGS报告常见定植菌或污染菌，与检测标本类型、采集方式、检测环境有关，可依据传统微生物学中基础知识初步判断。工程菌则与检测环节所用的试剂有关，如果某一批检测样本的报告出现少见的微生物，应注意检测过程中空白对照的检出情况。mNGS检测的目标是核酸，而并非存活的病原微生物。DNA在体内需要一定时间降解，可能存在病原微生物已死亡而mNGS给出阳性结果，应注意甄别［57］。
共识32 mNGS报告中常规容易培养的病原菌，建议临床医师结合传统方法，综合判断其临床价值。
对于常规容易培养的病原菌，如革兰阳性菌中的葡萄球菌属、肠球菌，革兰阴性菌中的肠杆菌目、非发酵菌等，传统的培养方法能给出较好的结果，并非mNGS的优势所在［1， 58］。
共识33 建议对于在核酸提取过程中破壁困难的微生物，如分枝杆菌属、诺卡菌属、真菌（主要包括曲霉菌、毛霉菌、隐球菌属与双相真菌）等，即使在检测报告中读长数较低，也要考虑其为致病微生物的可能，并采用其他方法验证，如特异引物的PCR或一代测序等分子生物学检测，G试验，GM试验，曲霉菌IgG抗体或隐球菌荚膜多糖抗原等血清学试验。
对于上述核酸提取较为困难的微生物，应注意mNGS提供的线索，进一步确认与排除［14， 29， 48， 56， 59］。
共识34 采用mNGS进行病原微生物鉴定的同时，可以考虑检测耐药基因，但需要将耐药基因准确定位到具体的病原体上以明确其临床价值。即通过对mNGS测得序列进行具体病原体基因组组装之后，确定耐药基因位于哪个病原体上，位于质粒上还是位于染色体上。
目前，对原始样本直接检测耐药基因指导临床使用抗微生物药物，还存在很多疑问，对于正常有菌部位样本，将耐药基因与特定病原微生物准确匹配存在较多困难。对于生长缓慢，而其耐药基因型与表型有良好相关性的病原菌，可对纯菌落进行全基因组测序（whole genome sequencing，WGS），推测耐药情况。如克拉霉素是治疗脓肿分枝杆菌重要的抗微生物药物，但是表型药敏实验非常复杂耗时，WGS检测脓肿分枝杆菌erm（41）与rrl基因点突变，可准确预测耐药情况［60］。对于结核分枝杆菌，WGS可以预测异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氧氟沙星的耐药状况，具有很好的特异性［60, 61, 62, 63］。如果待检样本仅有单一病原微生物检出，且读长较多，或者多种微生物存在，但是测序长度较长（如采用nanopore测序），耐药基因与微生物之间匹配，也可间接推测其耐药情况。
共识35 mNGS对于新发或少见病原微生物的检出具有重要价值。建议解读报告单前应了解比对数据库的内容，明确其是否涵盖少见病原或新发病原。检出高致病性病原微生物，应及时与临床联系。
mNGS的优点之一是能够诊断出少见的感染微生物。从公共卫生的角度来看，mNGS检测可以提供新出现或重新出现的高致病病原体的证据，检出不常见病原体可以报告给公共卫生机构，公共卫生机构可以协助进行后续的确认测试。
对于新发病原，如新型冠状病毒，mNGS以较快速度明确了病原，为下一步的检测、诊断、治疗、疫苗制备提供了条件［64］。对于少见病原，如鼠疫耶尔森菌、双相真菌（如马尔尼菲蓝状菌、荚膜组织胞浆菌、球孢子菌等）、耶氏肺孢子菌、钩端螺旋体、以及各种寄生虫（如阿米巴原虫、疟原虫）引起的感染；或原始样本中数量较少的病原，如脑脊液中的诺卡菌属、曲霉菌属、结核分枝杆菌，临床实验室常缺乏有效的检测手段，需要mNGS的结果提供线索作为参考。当然也必须与临床症候有明确相关性，方可考虑为致病微生物［13， 50， 56， 64］。
共识36 mNGS结果为阴性，对于排除感染常具有较好的阴性预测值。但对于某些病原微生物，如结核分枝杆菌等，原始样本中含量较少，或核酸提取困难的病原微生物，应考虑mNGS检测灵敏度较低，阴性预测性差，并不一定优于PCR等常规检测方案。
准确的mNGS阴性结果可能表明感染的可能性较低，因此有可能作为“排除”实验（虽然也可能需要其他检测，例如血清学检测）。未检测到病原体核酸序列，多数情况下可以排除感染微生物的存在，但是对于感染病原微生物数量少或核酸提取困难的微生物，判断应谨慎［9， 57， 65, 66］。对于呼吸道样本，mNGS对于结核分枝杆菌的检出率并不优于GeneXpert，而对于脑脊液等无菌部位样本，mNGS常有较好的表现［29， 67, 68］。例如：对于脑脊液模拟样本，mNGS对不同的病原微生物LOD：巨细胞病毒（9.4拷贝数/ml），HIV-1（100.8拷贝数/ml），肺炎克雷伯菌（8.7 CFU/ml），无乳链球菌（8.9 CFU/ml），新型隐球菌（0.01 CFU/ml），黑曲霉菌（130 CFU/ml），弓形虫（55个/ml）［48］。各检测实验室可以确定自己检测的LOD。mNGS依然需要与传统方法（包括培养、PCR、血清学实验）结合才能更准确地诊断［48］，Wilson等［13］研究表明mNGS对脑脊液检测阴性的脑膜炎或脑炎患者，有18例是通过血清学实验明确诊断。
共识37 建立mNGS病原诊断的阈值影响因素较多，包括测序平台、测序流程、标本类型、病原种类、患者状况，目前尚无统一公认的阈值，建议各实验室建立自已的阈值，并在临床工作中加以验证。
对于无菌部位样本，检出微生物核酸序列可能有较大临床价值，但应排除污染菌、工程菌、cfDNA、检测流程等干扰［69］。对于正常有菌部位的样本，情况要复杂得多，除了病原微生物的种类外，还要综合考虑宿主的因素。实验室可根据自己条件建立阈值。如：Wilson等［13］对脑脊液的mNGS研究中，对于病毒（DNA或RNA病毒），检出读长应至少覆盖全基因组的3个非重叠区域，判断为阳性；对于细菌、真菌与寄生虫，RPM（指每百万序列的特异性读长比率，RPM=RPM脑脊液/RPM非模板对照）≥10，判断为阳性。Miao等［1］将mNGS检出真菌（种水平）的读长数是其余真菌的5倍以上，判断为阳性；mNGS只要检测到1条属水平的结核分枝杆菌复合群读长，即判断为阳性［70］。
共识38 不同病原微生物读长对结果判断的影响：同等条件下（相同微生物，相同标本），如某一微生物检出的读长数量多，为致病微生物的可能性大。但是，不同病原微生物基因组大小不同（寄生虫>真菌>细菌>病毒），核酸提取效率存在差异［难易程度：病毒<革兰阴性菌<革兰阳性菌（不包括分枝杆菌、需氧放线菌等）<真菌］，致病力也相去甚远，因此不能仅仅依靠读长多少来判断是否感染，建议同时考虑病原微生物种类差异与致病特性［71, 72］。
共识39 mNGS病原微生物检测结果，建议由具有一定生物信息学知识，并从事临床感染或临床微生物等专业人员，结合患者临床背景、影像学资料、其他的实验室检查结果，综合判断。不加以正确解读与甄别，盲目依据mNGS报告开展治疗，必将导致抗微生物药物的滥用［71, 72, 73］。
临床感染病原学诊断是具有挑战性的工作［56, 57， 65］。mNGS仅检测样本中的核酸（包括DNA与RNA），是否反映患者真实感染状况，需要将检测结果与临床情况结合，核对甄别。mNGS技术检测的是核酸，不能简单将核酸等同于病原微生物。血浆cfDNA的mNGS检出结果，仅有50%与临床相关［57］。
综上，本文对mNGS技术应用于感染性疾病病原检测的质量管理进行了推荐，并给出了推荐强度。因为该技术可对部分病例的病原诊断产生决定性影响，现实中又存在种种问题［74, 75］，所以需要确保该技术的检验质量，并需要进行持续性评估。在评估结果明朗、中国国家药品监督管理局正式批准应用之前，理性、有节制、可信地应用该技术始终是一个挑战。既有的专家共识［71, 72, 73］和本专家共识将有益于业界对该技术的恰当应用。
执笔：
陈宏斌（北京大学人民医院检验科），宁永忠（清华大学附属垂杨柳医院检验科），鲁炳怀（中日友好医院呼吸与危重症医学科），尹玉瑶（北京大学人民医院检验科）
编写组成员（按姓名拼音顺序）
阿祥仁（青海省人民医院检验科），安友仲（北京大学人民医院重症医学科），曹彬（中日友好医院呼吸与危重症医学科），曹敬荣（首都医科大学宣武医院检验科），陈佰义（中国医科大学附属第一医院感染科），陈宏斌（北京大学人民医院检验科），陈天艳（西安交通大学第一附属医院感染性疾病科），褚云卓（中国医科大学附属第一医院检验科），戴二黑（石家庄市第五医院检验科），戴媛媛（中国科学技术大学附属第一医院检验科），杜鸿（苏州大学附属第二医院检验科），杜艳（昆明医科大学第一附属医院医学检验科），高燕（北京大学人民医院感染科），耿燕（西安交通大学第二附属医院检验科），公衍文（山东大学第二医院检验医学中心），谷丽（首都医科大学北京朝阳医院感染和临床微生物科），顾兵（徐州医科大学附属医院检验科），胡必杰（复旦大学附属中山医院感染科），胡继红（国家卫生健康委临床检验中心微生物室），胡志东（天津医科大学总医院检验科），贾伟（宁夏医科大学总医院医学实验中心），李敏（上海交通大学医学院附属仁济医院检验科），李轶（河南省人民医院检验科），廖康（中山大学附属第一医院检验科），刘家云（空军军医大学第一附属医院检验科），刘根焰（南京医科大学第一附属医院检验学部），刘洪英（河北省人民医院感染性疾病科），刘文恩（中南大学湘雅医院检验科），刘学东（青岛市市立医院呼吸与危重症医学科），鲁炳怀（中日友好医院呼吸与危重症医学科），吕火烊（浙江省人民医院检验中心），马筱玲（中国科学技术大学附属第一医院检验科），穆红（天津市第一中心医院检验科），倪语星（上海交通大学医学院附属瑞金医院临床微生物科、医院感染控制管理科），宁永忠（清华大学附属垂杨柳医院检验科），邱海波（东南大学附属中大医院重症医学科），尚游（华中科技大学同济医学院附属协和医院重症医学科），佘丹阳（解放军总医院呼吸与危重症医学部），孙宏莉（中国医学科学院北京协和医院检验科），孙世俊（北京大学人民医院检验科），陶传敏（四川大学华西医院实验医学科），单斌（昆明医科大学第一附属医院检验科），王辉（北京大学人民医院检验科），王明贵（复旦大学附属华山医院抗生素研究所），王世富（山东大学齐鲁儿童医院临床微生物科），王一民（中日友好医院呼吸与危重症医学科），魏莲花（甘肃省人民医院检验科、甘肃省临床检验中心），吴文娟（同济大学附属东方医院医学检验科），伍勇（中南大学湘雅三院检验科），许建成（吉林大学第一医院检验科），许兰平（北京大学人民医院血液病研究所），杨青（浙江大学医学院附属第一医院检验科），杨志宁（山西省心血管病医院检验科），姚开虎（首都医科大学附属北京儿童医院微生物研究室），尹玉瑶（北京大学人民医院检验科），余方友（同济大学附属上海市肺科医院检验科），余跃天（上海交通大学医学院附属仁济医院重症医学科），俞云松（浙江大学医学院附属邵逸夫医院感染科），张静（复旦大学附属中山医院呼吸内科），张文宏（复旦大学附属华山医院感染科），赵彩彦（河北医科大学第三医院感染科），赵鸿（北京大学第一医院感染疾病科），赵建宏（河北医科大学第二医院检验科），郑美琴（温州医科大学附属眼视光医院检验科），周宏伟（南方医科大学珠江医院检验医学部），朱镭（山西省儿童医院临检中心），卓超（广州医科大学附属第一医院检验科）
志谢 中国医学科学院北京协和医院杜斌教授为本文提出的建议
参考文献（略）
附：2021年继续教育单项选择题（三）
1.下列关于mNGS的描述，错误的是（ ）
A.宏基因组高通量测序技术的英文是metagenomic next-generation sequencing，缩写是mNGS
B.其中m指宏基因组，也称元基因组，是标本中全部生物（人、微生物）基因组的总称
C.mNGS指对标本中的部分生物基因组进行NGS分析
D.在感染性疾病诊断领域中，mNGS侧重于微生物基因组的识别和分析。
2.关于mNGS适应证，耐药性检测描述正确的是（ ）
A.感染发生在正常有微生物定植的部位，不建议采用mNGS进行耐药性检测。
B.一律进行mNGS，和表型检测互相印证
C.任何情况下都不能进行耐药性检测，因为结果无法解释
D.对有菌种特异性的耐药性基因，在测序深度足够时，也不能考虑应用 mNGS检测获得性耐药基因
3.关于mNGS下列表述错误的是（ ）
A.mNGS整个实验流程需要防污染
B.mNGS敏感性高于qPCR
C.测序深度影响病原鉴定的敏感性
D.对于高宿主背景的样本应去除宿主核酸后测序
4.关于mNGS检测临床样本，下列说法正确的是（ ）
A.测序报告中最多读长数的微生物，为致病微生物
B.下呼吸道感染时，mNGS在肺泡灌洗液中未检出结核分枝杆菌序列，可以排除肺结核
C.怀疑血流感染时，采用血浆进行mNGS，若检出多种微生物的序列，应考虑样本在采集过程中污染所致
D.肺组织样本经mNGS检出新型隐球菌的序列，可考虑其为致病菌，必要时采用隐球菌荚膜多糖抗原实验验证
5.深部咳痰样本，mNGS检出下列哪一种病原的读长时，应高度怀疑为致病微生物（ ）
A.巨细胞病毒
B.马尔尼菲篮状菌
C.白念珠菌
D.鲍曼不动杆菌